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虚拟货币是指非真实的货币。知名的虚拟货币如百度公司的百度币、腾讯公司的Q币,Q点、盛大公司的点券,新浪推出的微币(用于微游戏、新浪读书等),侠义元宝(用于侠义道游戏),纹银(用于碧雪情天游戏),2013年流行的数字货币有,比特币、莱特币、无限币、夸克币、泽塔币、烧烤币、便士币(外网)、隐形金条、红币、质数币。目前全世界发行有上百种数字货币。圈内流行"比特金、莱特银、无限铜、便士铝“的传说。
根据中国人民银行等部门发布的通知、公告,虚拟货币不是货币当局发行,不具有法偿性和强制性等货币属性,并不是真正意义上的货币,不具有与货币等同的法律地位,不能且不应作为货币在市场上流通使用,公民投资和交易虚拟货币不受法律保护。
2021年5月18日晚间,中国互联网金融协会、中国银行业协会、中国支付清算协会联合发布《关于防范虚拟货币交易炒作风险的公告》。公告明确表示,有关机构不得开展与虚拟货币相关的业务,同时提醒消费者要提高风险防范意识,谨防财产和权益损失。
温馨提示:以上解释仅供参考,在投资之前,建议您先去了解一下项目存在的风险,对项目的投资人、投资机构、链上活跃度等信息了解清楚,而非盲目投资或者误入资金盘。投资有风险,入市须谨慎。
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(Yeast artificial chromosomes YACs)PYAC4 遗传结构图
YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的染色体的复制元件构建的载体,其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形,生长的代时为 90 分钟;含 16 条染色体,其大小为 225-1900kb ,总计有14×106 bp;具真核 mRNA 的加工活性。
1.YAC人工染色体载体的复制元件和标记基因
在 YAC 载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的,因此其在工作状态也是线状的。但是,为了方便制备YAC载体, YAC 载体以环状的方式存在,并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记,以便保存和增殖。
YAC 载体的复制元件是其核心组成成分,其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列(autonomously replicating sequence, ARS)、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 (centromere , CEN)和两个端粒(TEL)。
YAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要,必须含有以下元件:
·端粒重复序列(telomeric repeat , TEL):定位于染色体末端一段序列,用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解,以形成稳定的结构。
·着丝粒(centromere , CEN):有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点, 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。
·自主复制序列(autonomously replication sequences,ARS) 一段特殊的序列,含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。
YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因,如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等,以及赭石突变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落,当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时,可抑制 ade 2-1基因的突变效应,形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象,可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。 (Bacterial artificial chromosomes,BACs)
1.F 质粒
大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质(Willetts and Skurray,1987)。虽然F因子通常以双链闭环DNA(1-2个拷贝/细胞)的形式存在,但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合(Low,1987)。携带F因子的细胞,或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。 是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的,高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记,一个来源于大肠杆菌 F 因子(致育因子)的严谨型控制的复制子 oriS ( Shizuya et al. 1992 ),一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶( (RepE) 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 ( parA , parB , 和 parC ) 。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生,减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。第一代 BAC 载体 (Shizuya et al. 1992) 不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的 BAC 载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子,并设计了用于回收克隆 DNA 的 Not Ⅰ 酶切位点和用于克隆 DNA 测序的 Sp6 启动子、 T7 启动子 (Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997) 。 Not Ⅰ 识别序列,位点十分稀少。重组子通过 Not Ⅰ 消化后,可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是来源于噬菌体的启动子,用于插入片段末端测序。图 3-28 是 pBeloBAC11 遗传结构图。
BAC 与 YAC 和 PAC(P1 artificial chromosomes , P1 人工染色体 ) 相似,没有包装限制,因此可接受的基因组 DNA 大小也没有固定的限制。大多数 BAC 文库中克隆的平均大小约 120kb ,然而个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 最大可达 300kb 。
F 质粒能够编码形成性菌的蛋白,通过大肠杆菌的结合转移可以进行遗传物质的转移。但是基因操作的时候一般不用这种自发的转化方式。 BAC 载体空载时大小约 7.5kb ,在大肠杆菌中以质粒的形式复制,具有一个氯霉素抗性基因。外源基因组 DNA 片段可以通过酶切、连接克隆到 BAC 载体多克隆位点上,通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。装载外源 DNA 后的重组质粒通过氯霉素抗性和 Lac Z 基因的 α – 互补筛选。
三、P1 噬菌体载体和 P1 人工染色体载体 (Bacteriophage P1 vectors)
是 Sternberg 基于 P1 噬菌体构建的,与黏粒载体工作原理比较相似的一种高通量载体。它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件,能容纳 70~100kb 大小的基因组DNA片段(Sternberg 1990, 1992, 1994) 。在这种系统中,含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中,后者总容量可达 115kb (包括载体和插入片段)。将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠杆菌中,线状 DNA 分子通过重组于载体的两个 loxP 位点之间而发生环化。另外,载体还携带一个通用的选择标记 kan r ,一个区分携带外源 DNA 克隆的阳性标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒复制子。另一个 P1 复制子( P1 裂解性复制子)在可诱导的 lac 启动子(IPTG 诱导)控制下,用于 DNA 分离前质粒的扩增。图 3-29 是 P1 噬菌体载体 pAd10sacBII 的遗传结构图。2.P1 人工染色体(P1 artificial chromosomes)
结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性,包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。然而除了将连接产物包装进入噬菌体颗粒以及在 cre-loxP 位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外,在载体连接过程中产生的环状重组 PAC 也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中,并且以单拷贝质粒状态维持 (Ioannou et al. 1994) 。基于 PAC 的人类基因组文库插入片段的大小在 60kb~150kb 之间。
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BAC是细菌人工染色体意思,之所以有BAC文库的出现,是因为基因组序列太长,测序,以及筛选基因等没有办法完成,所以将基因组片段随机打断成片段,连到载体上构建成一系列的重组子,这样当你需要特定的序列,只需要筛选出自己要的那个bac重组子就行了。说的有点过于简单,不知道你能明白否?末端测序也是采用的双脱氧终止法的。双脱氧终止法的原理是;碱基之间是通过俩个碱基的5‘磷酸基团和3’羟基连接的,双脱氧终止法就是利用了这个3‘羟基,将3’羟基脱氧变成氢键,那么这样下一个碱基的5‘磷酸基团就没有办法连到前一个碱基上了。所以如果在做测序pcr的时候加一部分正常的dNTP(3号位为羟基),加一定量的ddNTP(2,3号位都是氢键),那么在第一个碱基后如果接上去的是dNTP,那么就可以接着连第三个碱基,如果连得是ddNTP,那么就没有办法连下个碱基形成链终止,在测序pcr中,数以万计的反应,那么就会出现2个碱基后终止的链,也有可能出现3个,4个,N个碱基后终止的链,这样就形成了一系列从一个碱基到N个碱基的序列(其最后一个碱基都是三号位为氢键的,这个应该理解吧)。那么如果我们在连上去的ddNTP上连上个荧光基团(四种ddNTP连上不同的荧光基团),那么将这一系列长度的链跑胶,会形成一系列的带,通过每条带最后一个碱基的荧光通过机器就能够区分是什么碱基,将这些碱基拼接好后就是你要的序列了。
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评论
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